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學術文章

王鋼論文《遼寧中醫雜志》腎炎靈對大鼠腎系膜

來源:未知 作者:njboda 時間:2014-10-30 20:20

文獻出處:《遼寧中醫雜志》  2005年第32 卷第9期

 

腎炎靈對大鼠腎系膜細胞增殖影響的實驗研究

劉麗,  王鋼,  倪斌

(江蘇省中醫院全國中醫腎病三級實驗室, 江蘇 南京 210029 )

摘  要: 目的: 研究治療慢性腎炎有效的中藥復方腎炎靈對大鼠腎系膜細胞增殖的影響。方法: 取SD 大鼠腎臟進行腎系,膜細胞體外培養, 用腎炎靈浸青喂服系膜增生性腎炎大鼠, 將含藥大鼠血清、模型組大鼠血清、正常大鼠血清加入到體外培養的大鼠系膜細胞中, 應用M竹法、流式細胞儀檢測方法研究腎炎靈對系膜細胞的增殖和細胞周期的影響。結果: 喂服中藥腎炎靈浸青大鼠的血清與正常組、模型組大鼠血清相比, 顯著抑制體外培養系膜細胞的增殖, 且將系膜細胞增殖阻滯在G。~ G1期。結論: 腎炎靈臨床治療有效的機制可能與抑制腎系膜細胞增殖有關。

關鍵詞: 腎炎靈; 系膜細胞; 增殖; 動物實驗; 中藥

中圖分類號: R285.5   文獻標識碼: B   文章編號: 1000一1719(200 5)09一0969一03

    中藥復方腎炎靈對慢性原發性腎小球疾病、難治性腎病綜合征有確切的臨床療效, 且能明顯降低患者的蛋白尿、紅細胞尿, 改善腎小管間質和腎功能損害,明顯降低患者的過氧化脂質、血漿和紅細胞的超氧陰離子和SOD 活性陽1-3。本實驗擬研究益腎清利中藥復方腎炎靈對體外培養大鼠系膜細胞增殖和細胞周期的影響, 從細胞水平進一步深人探討其作用機制。

1   材料與方法

1.1 材料

    動物: 遠交系健康雄性SD大鼠5只, 體重150土21g,由南京中醫藥大學實驗動物中心提供(實驗動物使用許可證號SYXK<蘇>2001一2010)。

    藥物及主要試劑: 腎炎靈浸膏, 主要成分有雷公藤、蜀羊泉、生黃茂等, 由連云港康緣制藥有限公司生產, 批號010215。每克浸膏干粉含生藥9.4g, 成人日用量生藥45g/60kg , 相當于腎炎靈片為4.8g/60kg。RP -MI l640 (GIBC0)、胎牛血清(FCS , Hyelone )、膠原酶lV型(Sigma )、M件(Sig ma )、胰蛋白酶(進口分裝)、HEP-E S(B.M.)。

    主要儀器: 重慶XDS一1B 倒置生物顯微鏡, LDZS一2 離心機, DKB 一SA型電熱恒溫水槽, SW一CJ 一IF 凈化工作臺, Forma311IC 02培養箱, BI0 一RAD355O型酶標儀,FACsealibur 流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備       SD大鼠經適應性喂養1 周后, 隨機分為正常組、模型組、腎炎靈浸膏低劑量組、中劑量組、高劑量組, 每組10只。參照文獻4 制作系膜增生性腎炎大鼠模型, 腎炎靈浸膏治療組自造模預免疫后開始給藥, 根據文獻5換算劑量, 腎炎靈低劑量組每只大鼠每日用藥劑量0.15g/kg (合生藥1.41g/kg);腎炎靈中劑量組每只大鼠每日用藥劑量0.4g/kg(合生藥4.14 g/kg );腎炎靈高劑量組每只大鼠每日用藥劑量1.31g/kg(合生藥12.31g/kg )。正常對照組灌服等量蒸餾水。全部大鼠于正式免疫8周后分別眼眶靜脈叢取血, 所取大鼠血液經300Or/min 離心10min取血清, 56℃水浴30 min滅活, 0.22μm無菌濾器過濾除菌, 分裝, --80℃保存備用。

1.2.2 細胞培養及鑒定      斷頭處死5只SD大鼠, 快速取出腎臟, 無菌Hanks 緩沖液洗滌腎臟, 剝去腎包膜, 剪刀剪取腎皮質成小碎塊狀, 經80目、150目、200目不銹鋼網篩過濾分離腎小球,W 型膠原酶37℃水浴消化, 間隔振搖約15min,用不完全培養基離心洗滌后,完全培養基懸浮腎小球, 接種于塑料細胞培養瓶中, 鏡下觀察腎小球消化和密度情況,37℃、5% CO2 : 靜止培養。細胞進行結蛋白、角蛋白免疫熒光鑒定。傳代培養出大量細胞后進行下面實驗。

1 .2. 3 含藥大鼠血清對系膜細胞增殖抑制的影響      參照文獻6, 0.25 % 胰酶消化大鼠系膜細胞, 調細胞密度為約lx105 )個/ m L , 接種于96孔培養板上, 每孔200μL ,37℃ 、5%CO2培養4 8 h 后系膜細胞完全貼壁,棄培養液, 分別加人不同濃度(2.5 % 、5 %、10 % ) 正常大鼠血清、模型組血清及腎炎靈高、中、低劑量組血清,并用Fcs分別補足血清濃度至20 % , 培養24、48 h。每組培養結束前4h 加人MTT (5 g/L)20uL/孔, 結束培養時棄上清, 加入DMS0 150μL/孔, 振蕩l0 min , 酶標儀上測定OD490值。統計學方法采用SPSS1O.O軟件,One 一Way ANOVA 方法分析。

1.2. 4 含藥大鼠血清對系膜細胞周期的影響      0.25 %胰酶消化系膜細胞, 調細胞密度為約lxl05個/ m L , 接種于細胞培養瓶中, 預培養48 h 待系膜細胞完全貼壁后, 棄舊培養基, 將細胞分成3 組: (1 )10% 正常大鼠血清; (2 ) 10 % 模型組血清; (3 )10 % 腎炎靈中劑量組血清。每組分別用FCS 補足血清濃度至20 %,37 ℃ 、5 %CO2 分別培養24、48 h。每組設3個平行實驗。培養結束后, 消化培養瓶內細胞, I000 r/min 離心5min, 棄上清液。PBS工作液洗滌細胞2次, 調細胞密度為約lx106/ m L,將細胞懸浮于PI 低滲液中, 置4 ℃染色20min , 過濾, 流式細胞儀檢測細胞周期。統計采用t檢驗。增殖指數7(PI) =(S+G2/M )( G0/Gl+S+G2/M ) ×100%。

2   實驗結果

2.1  細胞增殖檢測     處理24h:2.5%含藥血清處理時,腎炎靈高劑量組與正常組、模型組有極顯著差異(P< O.0l )。5.0%含藥血清處驗理時, 腎炎靈高、中劑量組與正常組有顯著差異(P < 0.01 )。10.0%含藥血清處理時,腎炎靈高、中劑量組與正常組有極顯著差異(P<0.05、P<0.01),腎炎靈高、中劑量組與模型組有顯著差異(P< 0.01 ),腎炎靈低劑量組與模型組有顯著差異(P<0.05),模型組與正常組有顯著差異(P<0.05),見表1。處理48h:2.5%含藥血清處理時,腎炎靈高劑量組與模型組有顯著差異(P<0.05。5%含藥血清處理時,腎炎靈高、中劑量組與正常組、模型組皆有極顯著差量組與模型組皆有極顯著性差異(P< 0.01 )。10.0% 含藥血清處理時, 腎炎靈高劑量組與正常組有極顯著差異(P< 0.01 );腎炎靈高、中、低劑量組與模型組皆有極顯著性差異(P< 0.01 ),見表2。

表1 大鼠腎系膜細胞培養24OD490 ( X- 士 S )

濃度

正常組

模型組

高劑量組

中劑量組

低劑量組

2.5%

0.224±

0.008

0.218±

0.006

0.193±

0.010

0.207±

0.009

0.217±

0.004

5.0%

0.165±

0.007

0.153±

0.004

0.144±

0.004**

0.147±

0.001**

0.165±

0.010

10%

0.217±

0.010

0.248±

0.005*

0.161±

0.145△△

0.221±

0.026**△△

0.217±

0.019

注: 與正常組比較, * P <0.05, **P<0.01; 與模型組比較,P< 0.05, △△P<0.01 。 

表2 大鼠腎系膜細胞培養48OD490 ( X- 士 S )

濃度

正常組

模型組

高劑量組

中劑量組

低劑量組

2.5%

0.231±

0.035

0.251±

0.014

0.220±

0.012

0.238±

0.034

0.230±

0.021

5.0%

0.244±

0.011

0.249±

0.015

0.192±

0.006**△△

0.201±

0.024**△△

0.230±

0.013

10%

0.223±

0.025

0.242±

0.004

0.193±

0.009**△△

0.202±

0.022△△

0.207±

0.009△△

注: 與正常組比較, * P <0.05, **P<0.01; 與模型組比較,P< 0.05, △△P<0.01 。 

2.2 倒置顯微鏡觀察     含腎炎靈藥物血清作用細胞后, 系膜細胞收縮明顯, 間距增大, 胞質中顆粒物增多, 透明度降低, 有部分細胞懸浮, 隨時間延長漂浮細胞形態始終為梭形或星形等。對照組細胞生長狀態良好, 透明度高,細胞形態始終為梭形或星形等。

2.3 腎炎靈浸膏對大鼠系膜細胞周期的影響       從表3、表4 可知, 處理細胞24h、48h, 腎炎靈組PI 與模型組比較皆有極顯著差異(P< 0.01 ) , 處理細胞24h 模型組PI 與正常組比較有顯著差異(P< 0.05 ) , 處理細胞48h , 模型腎炎靈組與正常組比較有顯著差異(P< 0. 05 ) , 模型組與正常組相比有顯著差異。由此可看出, 經腎炎靈藥物處理后, 大量系膜細胞被阻滯在G0一G1成分, 抑制了細胞有絲分裂, 抑制了細胞增殖。

3   討   論

    大量研究表明, 系膜細胞是腎小球疾病中扮演重要角色的腎小球固有細胞之一, 以炎癥為主的腎小球疾病早期均伴有明顯的系膜細胞增殖。系膜細胞的增殖和細胞外基質的積聚是導致腎小球疾病進一步惡化的主要因素。抑制系膜細胞的增殖則可減緩腎小球硬化和腎間質纖維化。中藥復方腎炎靈清補結合, 為脾腎雙補、清利兼施之劑。

    本實驗結果表明, 10%大鼠血清作用24 h 后, 模型組與正常組相比有顯著差異, 說明模型組血清能促進系膜細胞增殖, 模型組血清中含有一些促細胞增殖的成分, 體現了一定的“ 病理” 效應。而同時, 腎炎靈高、中、低劑量組與模型組均表現為顯著性差異, 表明腎炎靈能抑制病理狀態下的系膜細胞增殖。但是模型組血清對系膜細胞的促增殖作用并不表現為時問效應,因為當10% 含藥血清處理48 h 后, 模型組雖然均值比正常組高, 但差異并不顯著, 說明模型組血清內促增殖因子“ 有效” 作用時間具有一定的局限性。無論模型組血清與正常組血清對細胞促增殖的作用差異是否顯著, 腎炎靈高、中、低劑量組血清都表現了對細胞增殖的抑制作用, 且隨著劑量組由高到低、濃度由大到小依次表現為抑制細胞增殖, 體現了一定的濃度效應。

    細胞周期是指細胞從上一次細胞分裂結束到下一次分裂終了的過程。細胞周期由Gl 期、S 期、G2期和M 期組成。G1期、S 期和G2期為合成間期,M 期即分裂期。Go期細胞是指細胞分裂后相對穩定的細胞, 在適宜的刺激下, 細胞能被觸發, 從靜止狀態進人增殖狀態。細胞周期中有2個決定性階段: 第一個決定性階段是從Gl 過渡到S 期, 此時DNA 開始復制; 另一個決定性階段是從G2過渡到M 期, 此時染色體濃縮,有絲分裂開始。本實驗結果體現為在含藥血清作用后, 系膜細胞被阻滯于G0一G1期, 從而在一定程度上抑制了細胞有絲分裂的發生, 表明中藥復方腎炎靈抑制細胞增殖的細胞周期決定性階段是G0 一G1 期。

    腎炎靈高、中、低劑量組血清均由造模動物喂服中藥后而獲得, 這與一般的從喂服中藥的正常大鼠中獲取血清不同, 它是病理狀態下治療疾病后的血清,其既內含中藥有效成分又可能內含疾病狀態下機體代謝的有效成分, 因此用造模后喂服中藥的血清做實驗更能反映藥物的治療機理。以上實驗結果表明腎炎靈治療腎小球疾病的有效作用機理與其對腎系膜細胞的增殖有顯著抑制作用有關, 且將細胞增殖阻滯于G0 一Gl期。

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