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學術文章

王鋼論文《中成藥》積雪草對大鼠系膜細胞轉化

來源:未知 作者:njboda 時間:2014-10-30 20:31

文獻出處:《中成藥》 2003年4月第25卷第4期

積雪草對大鼠系膜細胞轉化生產因子-β1的影響

黃懷鵬1 ,  王 虹2 ,  王 鋼1

(1. 江蘇省中醫院腎病實驗室,江蘇南京210029;

 2. 天津中醫學院中心實驗室,天津300193)

    關鍵詞:積雪草,系膜細胞,轉化生長因子---β1

    中圖分類號:R285. 5   文獻標識碼:B    文章編號:100121528 (2003) 0420330202

   積雪草為傘形科植物,具有清熱利濕、解毒散瘀活血的作用,本品始載于《神農本草經》列為中品。謂本品“主大熱,惡瘡,癰疽,浸淫,皮膚赤,身熱”。《陸川本草》進一步言其能“解毒,瀉火,利小便。治熱性頭痛、身熱、口渴、小便黃赤”。近年國內逐漸應用于慢性腎臟病的治療。為進一步探討其作用機理,本研究利用血清藥理學方法,觀察積雪草在體外對腎小球系膜細胞的影響。

1  動物

    健康雄性Wistar 大鼠, ♀♂不限,體重140~180g ,共12只,用于體外腎小球系膜細胞培養。體重180~220g ,共6只,用于動物含藥血清的制備。

2  試劑及實驗用藥

    胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶、Hepes (Sigma 公司產品) ,RPMI21640 (內含2mmol/ L2谷氨酰胺GIBCO 公司產品) ,特級胎牛血清(HyClone 公司產品) ,血管緊張素Ⅱ(AT Ⅱ Sigma 公司產品) ,積雪草購自江蘇省中醫院中藥房。

3  主要儀器

    倒置相差顯微鏡( ECL IPSE TE300 型, 日本Nikon 公司) ,CO2 恒溫培養箱( TC2323 型,美國Shelolon Manufacture公司) ,酶標儀(奧地利TECAN 公司Spectar Ⅲ) 。

方法

4  藥物血清制備

    將6 只Wistar 大鼠隨機分為2 組,即積雪草血清組、空白血清組,每組3 只。

    4.1  積雪草血清的制備 根據陳奇主編《中藥藥理學研究方法》,每日以成人劑量/ 公斤的10 倍,分2 次灌胃,連續3d ,最后1 日2 次給藥間隔時間為2h ,并于末次給藥后1~2h ,無菌操作,心臟取血,分離血清,并將含藥血清置于56°C 水浴箱中30min 滅活處理, - 20°C 冰箱保存備用。

    4.2  空白血清制備 空白血清組大鼠每日灌服同藥物劑量的生理鹽水,在藥物血清采血的同時采血,分離血清方法同前。

5  腎小球系膜細胞培養及鑒定

    參照諶貽璞報道的方法進行培養腎小球系膜細胞(MC) ,取培養第3 代MC ,經形態學及抗結蛋白抗體免疫組化染色鑒定后用于實驗。

6  系膜細胞增殖及TGF2β1 的檢測

    6.1  實驗分組與給藥取3 代MC ,用20 %FBSRPMI21640 培養液,以密度1 3105·mL - 1 轉種于96 孔板內,200μL ·孔- 1 ,培養24h 后,用0. 5 %FBS RPMI21640 培養液200μL·孔- 1 ,培養24h ,使細胞

同步于G0 期。然后分為(1) 空白組: 加5 %空白血清; (2) 模型組:加AT Ⅱ10 - 6M 和5 %空白血清; (3) 低劑量組:加ATⅡ10 - 6M 和2. 5 %積雪草血清; (4) 中劑量組: 加AT Ⅱ10 - 6和5 %積雪草血清; (5) 高劑量組: 加AT Ⅱ10 - 6M 和10 %積雪草血清,每組設6 個復孔,并以FBS 將每孔的血清濃度補至15 % ,每孔培養液總量為200μL ,并于給藥后4 ,8 ,16 ,32h分別檢測TGF2β1 的含量。48h 測定MC 增殖情況。

    6.2  系膜細胞增殖的測定(MTT 法)

    將MTT 溶液(5mg·mL - 1) 加入長有MC 的96 孔板中,20μL·孔- 1 ,37°C、5 % CO2 條件下繼續培養4h ,終止培養,小心吸棄孔內的上清液。每孔加入150μL DMSO (二甲基亞砜) ,振蕩10min ,使結晶充分溶解。選擇490nm 波長,在酶標儀上讀出OD 值。

    6. 3  酶聯免疫法(雙抗體夾心法) 檢測TGFβ1 的含量    參照Promega TGFβ1 EL ISA 試劑盒說明書進行。

7  結果

    7.1  積雪草對腎小球系膜細胞增殖的影響, 見表1

表1  系膜細胞增殖的測定結果

n

空白組

模型組

低劑量組

中劑量組

高劑量組

OD值

6

0.432±0.015

0.628±0.0111)

0.492±0.0162)

0.451±0.0122)

0.405±0.0112)

             

注:1)與空白組相比P < 0. 01 ,2)與模型組相比P < 0. 05 或P < 0. 01 。

  結果表明積雪草血清能抑制血清緊張素Ⅱ刺激下的系膜細胞增殖,并呈現一定的量效關系。

    7.2  積雪草對腎小球系膜細胞分泌TGF-β1 的影響,見表2

8  討  論

    在慢性腎小球疾病中,系膜細胞(MC) 增殖和活化,伴隨著細胞外基質(ECM) 的過度表達,導致了腎小球硬化的產生。故而設法控制MC 增殖、減少ECM 的聚集,對爭取腎小球病變的逆轉和防止腎小球疾病慢性演變至腎小球硬化有重要意義。

表2  積雪草對系膜細胞中TGF-β1 的影響(pg·mL - 1)

組別

n

4h

8h

16h

24h

空白組

6

600.21±30.2

680.28±44.12

620.74±36.28

580.46±42.31

模型組

6

936.3±60.261

960.8±68.441

978.81±78.661

997.75 ±42.38

低劑量組

6

891.51±63.31

850.6±68.27

875.29±45.58

901.24±68.462

中劑量組

6

821.5±49.682

835.81±47.422

812.54±43.272

839.32±57.472

高劑量組

6

801.2±44.512

811.64±38.462

796.21±46.472

776.62 ±53.282

注:1)與空白組相比, P < 0.01 ,2)與模型組相比P < 0.05 或P <0.01 。

  結果顯示空白組大鼠系膜細胞的TGF-β1 的分泌量很少,模型組經血管緊張素Ⅱ刺激后, TGF-β1 的分泌量顯著增加,提示血管緊張素Ⅱ能明顯促進MC 分泌TGF-β1 。積雪草各組在各個時間點的TGF-β1 分泌量均減少,與模型組相比有明顯差異P < 0.05 ,且呈劑量依賴關系,說明積雪草血清能明顯抑制MC 分泌TGF-β1 。

  在慢性腎臟病進展過程中,MC 產生的細胞因子和生長因子如IL21 、IL28 、TNF2α、GM2CSF、M2CSF、PDGF、IGF21 、TGF2β1 以自分泌或旁分泌的機制促進MC 增殖,導致ECM聚集[1] ,進一步加重腎小球炎癥和硬化過程。其中最重要的是TGF-β1 ,TGF-β1 能刺激ECM 蛋白基因的表達,抑制多種ECM 降解酶的合成,增加ECM 受體的表達,以促進ECM 與細胞粘附[2] 。

    積雪草是傳統中藥之一,主要成分有β2谷甾醇(β-sitosterol) ,胡蘿卜苷(daucosterol) ,積雪草酸(asiaticacid) ,香草酸(vanillic acid) 和積雪草苷(asiaticosid e) [3] 。是臨床治療濕熱型腎臟病的常用中藥之一。因此我們運用積雪草含量血清作用于體外培養的腎小球系膜細胞,觀察其對MC 增殖和分泌TGF-β1 的影響。結果表明:積雪草含藥血清能明顯抑制系膜細胞增殖,并呈現劑量依賴關系,同時對導致腎小球硬化的關鍵纖維化因子TGF-β1 也有明顯的抑制作用。本實驗是利用積雪草全草制備含藥血清,作用于體外腎小球系膜細胞,而對其具體成分的研究,有待進一步深入探討。

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